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本试剂盒用于检测细胞凋亡早期的发生，其中Annexin V为胞内蛋白膜联蛋白家族成员，以钙离子依赖的方式选择性与磷脂酰丝氨酸(PS)结合。

PS正常分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把PS外翻到细胞膜外侧。用带有FITC标记的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以通过流式细胞仪或荧光显微镜检测到PS外翻这一细胞凋亡的重要特征。

7-氨基放线菌素D(7-AAD)是一种非浸入性染料，可以用来检测无活性的细胞。它不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对7-AAD的通透性逐渐增加。染料一旦进入细胞，它将结合到细胞内DNA分子上，在合适波长激发光的激发下发出明亮的红色荧光。7-AAD同PI有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品，可与Annexin V-FITC/PE联合使用。

将Annexin V-FITC与7-AAD联合使用时，7-AAD被排除在活细胞(Annexin V-/7-AAD-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/7-AAD-)外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC和7-AAD结合染色呈现双阳性(Annexin V+/7-AAD+)。

• 可立式离心管内试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• Annexin V-FITC和7-AAD是光敏物质，在保存与操作时请注意避光。
  
• 在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留影响实验结果。
  
• 为获得准确试验结果，建议样品在Annexin V-FITC染色后1小时内进行分析。
  
• 为了您的安全和健康，请穿戴实验防护服、手套、口罩等必要的防护装备。

• 样品染色
  
  • 将Binding Buffer(10×)稀释成1×Binding buffer工作液备用(1mL Binding Buffer(10×)需加入9mL无菌去离子水)。
    
  • 对于悬浮细胞：500～1000g离心5min收集细胞。
    对于贴壁细胞：要用不含EDTA的胰酶消化细胞，胰酶消化时间不宜过长或过短，最好是在轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，加入细胞培养液，将细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，500～1000g离心5min收集细胞。
    
  • 收集细胞后，加入预冷PBS溶液轻摇或用移液器轻柔吹打洗涤，离心收集细胞，共洗涤两次。
    
  • 在细胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液，重悬细胞，使细胞浓度达到1×10⁶ cell/ml。
    
  • 吸取100μL细胞悬液(细胞总数为1×10⁵cell)至一新管中，加入5μL Annexin VFITC和5～10μL 7-AAD，轻轻混匀，室温避光孵育15min。
• 样品检测
  
  • 流式细胞仪检测：
    染色孵育后，每管加入400μL 1×Binding Buffer工作液，混匀后使用流式细胞仪检测(1小时内检测)。
    建议设置正常细胞、7-AAD单染和Annexin V-FITC单染3个对照组，正常细胞组可作为荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。若十字门的位置不易设定，可采用经凋亡诱导的细胞进行设定。结果可用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图(two-color dot plot)，FITC为横坐标，7-AAD为纵坐标。Annexin VFITC和7-AAD联合使用时，活细胞仅有很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光，晚期凋亡细胞有绿色和红色双重荧光。
    
  • 荧光显微镜检测：
    染色孵育后涂片，显微镜下观察。使用荧光显微镜上的蓝光和绿光通道分别观察FITC和7-AAD。被Annexin V-FITC结合的细胞显示浆膜上有绿色光环。丧失细胞膜完整性的细胞，细胞核显示红色，膜上有绿色光环。